Donatello è un membro delle Tartarughe Ninja, un fittizio gruppo di guerrieri fantascientifici da cui prende il nome l’omonima serie di Kevin Eastman e Peter Laird. Nel primo episodio dei fumetti viene narrato che, a causa di un incidente automobilistico, il vaso che conteneva quattro piccole tartarughe precipitò in un tombino, seguito da un contenitore di sostanze radioattive smarrito dal rimorchio di un camion.{googleads right}

Nonostante la giovanissima età, le tartarughe sopravvissero alla caduta, rimanendo contaminate e subendo una mutazione genetica. Cresciuti nelle fogne di New York come esseri umanoidi, i quattro fratelli sono stati addestrati fino all’adolescenza da un anziano ratto mutante, il Maestro Splinter, che aveva appreso il ninjitsu osservando gli allenamenti del suo defunto padrone. Donatello, come i suoi fratelli, ha l’aspetto di una grossa tartaruga umanoide. Nei fumetti non è dato sapere di che specie si tratti in particolare, ma le tartarughe comunemente vendute nei negozi di animali appartengono al genere Pseudemys. La statura è di circa un metro e mezzo, mentre il peso si aggira intorno ai settanta – ottanta chilogrammi. La pelle è di colore verde, curiosamente priva di macchie o strie molto comuni invece nelle tartarughe acquatiche. Le sue mani sono munite di tre grosse dita, tra cui un pollice opponibile, mentre i piedi hanno soltanto due dita. La sua bocca è provvista di denti molto simili a quelli umani, mentre il collo è giuntato al cranio dal basso, e non dal dietro, come è invece solito nei rettili. È anche provvisto di una breve coda segmentata in tre sezioni. Possiede un carapace di forma ovale e colore verde intenso, che copre la schiena con i suoi scuti molto sporgenti. Il piastrone, di colore giallastro, è composto da sei parti: due quadrate ricoprono il petto, altre due analoghe rivestono l’addome, mentre due sezioni triangolari proteggono l’inguine. La corazza, assai utile in battaglia, è sprovvista della sezione laterale, e i fianchi sono quindi scoperti. Alcune inesattezze come questa possono essere dovute al fatto che, quando Eastman e Laird idearono i loro personaggi, ignoravano ancora alcune caratteristiche delle tartarughe.