Leonardo è un membro delle Tartarughe Ninja, un fittizio gruppo di guerrieri fantascientifici da cui prende il nome l’omonima serie di Kevin Eastman e Peter Laird. Nel primo episodio dei fumetti viene narrato che, a causa di un incidente automobilistico, il vaso che conteneva quattro piccole tartarughe precipitò in un tombino, seguito da un contenitore di sostanze radioattive smarrito dal rimorchio di un camion.{googleads right}

Nonostante la giovanissima età, le tartarughe sopravvissero alla caduta, rimanendo contaminate e subendo una mutazione genetica. Cresciuti nelle fogne di New York come esseri umanoidi, i quattro fratelli sono stati addestrati fino all’adolescenza da un anziano ratto mutante, il Maestro Splinter, che aveva appreso il ninjitsu osservando gli allenamenti del suo defunto padrone. Leonardo è il leader delle Tartarughe Ninja, e si è guadagnato questo ruolo per numerosi motivi. Il Maestro Splinter ha riscontrato in lui un forte senso di responsabilità, che lo qualifica come un adolescente assennato e giudizioso. Inoltre gode di uno stimabile coraggio, e riesce a mantenere la calma anche nelle situazioni più estreme. Leonardo è poi il guerriero che meglio di tutti ha recepito il messaggio del sensei, facendo del Bushidō la sua unica guida morale e spirituale. Si interessa di cultura zen, ama la tradizione giapponese e trascorre gran parte del suo tempo allenandosi. Leonardo ha fama di guerriero impavido e altruista, ma più volte ha dovuto esorcizzare i suoi demoni a seguito di brutali sconfitte. Anche nel fallimento, però, ha sempre dimostrato di essere pronto a sacrificare la propria vita per salvare quella dei fratelli; tanto da arrivare ad affrontare potenziali nemici anche se stremato e vicino allo svenimento. Il fatto che Leonardo abbia la carica di capogruppo, unito alla sua incredibile capacità di mantenere l’autocontrollo, prendendo sempre la decisione giusta, ha suscitato una certa invidia in Raffaello,che nonostante sia più abile nel combattimento avendo un carattere impulsivo, Splinter non lo considera adatto al titolo di capo gruppo, ma comunque è molto affezionato al fratello.